一、目的

掌握質粒的常用提取方法及其定量測定。
 
二、原理
質粒(Plasmid)是游離于細胞染色體之外的具有自行復制子的雙鏈閉環的DNA分子，其大小范圍從1kb至200kb以上不等。質粒分子本身含有復制功能的遺傳結構，能在宿主細胞獨立自主地進行復制，并在細胞分裂時保持恆定地傳給子代細胞。質粒帶有某些遺傳信息，所以會賦予宿主細胞一些遺傳性狀，根據質粒賦予細胞的表型可識別質粒的存在，是篩選轉化子細胞的根據。質粒的質粒分為兩類：原核細胞表達質粒和真核細胞表達質粒。
分子生物學實驗中用于重組DNA技術的質粒常常為經過改造的細菌質粒，它通常具有以下特征：①多克隆位點（MCS）：為一些限制性內切酶的單一識別位點，可將外源DNA在這些位點上插入構成重組體，而不破壞質粒的生存能力及特性；②選擇標志：常為抗藥性基因，如抗卡那霉素基因（Ken⁺）。這是一種顯性基因，其產物是一種酶，能夠分解相應的藥物（如卡那霉素）。因此，被這種質粒轉化的細菌便能夠在含有相應藥物的培養基中繁殖，據此可判斷細菌轉化實驗是否成功；③復制子（Promoter）：是一段具有特殊結構的DNA序列，能啟動DNA分子的自行復制，此外還帶有一些編碼質粒復制過程中必須的RNA和蛋白質的基因。
質粒提取的方法有多種：堿裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。本實驗采用堿裂解法，即在堿及SDS作用下菌體破碎，質粒釋出，而細菌染色體仍附在細胞膜上，可通過離心除去。
 
三、試劑
2M  Glucose          0.25ml
1M  Tris-HCl (pH 8.0)  0.25ml
0.1M EDTA (pH 8.0)    1.00ml
滅菌水               8.50ml，
臨用現配。   
2. 0.2N NaOH/1%SDS：
        滅菌水                7.00ml
       1N  NaOH            2.00ml
       10%  SDS            1.00ml
3. 氯仿（Chloroform）(AR)
4. 異丙醇（Isopropanol）(AR)
5. 70%冰乙醇（Ethanol）(AR)
6. 4M NaCl：116.9gNaCl溶于300ml蒸餾水中，再加蒸餾水至500ml。室溫保存。
7.  13%PEG8000：13g PEG8000溶于60ml蒸餾水中，再加蒸餾水至100ml，然后用0.22 μm濾器除菌過濾，4 ^oC保存。
8. 3M KAc（pH4.8）：29.4g KAc，加少量蒸餾水溶解，用乙酸將pH調至4.8（約50ml），再加蒸餾水至100ml，室溫保存。

9．去離子水
10．10mg/ml Rnase A：100mg DNase-free Rnase A加10ml TE緩沖液，加熱100 ^oC 10min以滅活DNase，然后逐漸冷卻。-20 ^oC保存。
11．1M Tris-HCl（pH8.0）：蒸餾水600ml；Tris 60.6g；HCl 15ml；用HCl將pH調至8.0，再加蒸餾水至500ml。
12．2M Tris-HCl（pH7.4）：蒸餾水300ml；Tris 121.2g；HCl 35ml；用HCl將pH調至7.4，再加蒸餾水至500ml。
13．2M 葡萄糖：36g葡萄糖，溶于60ml蒸餾水中，再加蒸餾水至100ml，然后用0.22 μm濾器除菌過濾，-20 ^oC保存。
14．0.1M EDTA:  18.7g EDTA-Na₂-2H₂O，溶于300ml蒸餾水中，加入1 N NaOH約40ml，繼續將pH調至8.0，加蒸餾水至500ml, 室溫保存。
15．1N NaOH：40g NaOH，溶于60ml蒸餾水中，再加蒸餾水至1000ml，室溫保存。
16．10%SDS：10g SDS，溶于60ml蒸餾水中，再加蒸餾水至100ml，室溫保存。
17．TE緩沖液：10mM Tris（pH7.4）0.5ml；0. 1Mm EDTA（pH8.0）0.1ml；加蒸餾水至10ml。
18．50mg/ml卡那霉素
 
四、實驗儀器
1.      37℃水浴箱  (北京市醫療設備廠 型號：BS2型)
2.      高速離心機  (珠海黑馬醫學儀器有限公司 型號：TGL-16H型)
3.      紫外分光光度計    (上海第三分析儀器廠 型號：UV-754型)
4.      4℃低溫離心機    (珠海黑馬醫學儀器有限公司 型號：TGL-18R型)
5.      離心管（1.5ml和0.5ml）
6.      微量加樣器吸頭
7.      微量加樣器（1—10μl，1—100μl，200μl，1000μl）
8.      冰盒
 
五、實驗步驟
1．將含pBKcmv-hMLCK1的XL1-blue大腸桿菌接種到含有卡那霉素的固體培養基上（每毫升培養基加1μl 50mg/ml卡那霉素），37 ^oC孵育24h；
2．用滅菌牙簽挑選一單個菌落接種到3.0mlLB培養基中(含3μl卡那霉素)，37 ^oC振蕩培養過夜；
3．3000rpm離心10min；輕輕傾去上清液，離心管倒置濾紙上片刻；
4．將沉淀重懸于200μl GTE緩沖液中，轉移至1.5ml 離心管中；
5．加300μl NaOH/SDS液，顛倒混勻，置冰上5min；
6．加300μl 3M KAc（pH4.8），混勻，置冰上5min；
7．14000rpm，離心10min，將上清液移入另一1.5ml離心管中；
8．上清液中加1.6μl 10mg/ml Rnase A，37 ^oC孵育20min；
9．加氯仿400μl，混勻30sec，14000rpm離心1min，取上清液0.7ml置另一1.5ml離心管中，再用400μl氯仿提取一次；
10．取上清液0.6ml加入等體積異丙醇，混勻，14000rpm離心10min，傾去上清液，離心管倒置濾紙上片刻；
11．沿管壁慢慢加入0.5ml預冷70%乙醇，洗滌沉淀，14000rpm離心5min，傾去上清液，離心管倒置濾紙上片刻，真空干燥5min或室溫干燥；
12．用32μl滅菌水溶解沉淀物，加8μl 4M NaCl和40μl 13%PEG8000，混勻，置冰上20min；
13．14000rpm，4 ^oC離心15min，棄去上清液；
14．沿管壁慢慢加入0.5ml預冷70%乙醇，洗滌沉淀，14000rpm離心5min，傾去上清液，離心管倒置濾紙上片刻，真空干燥5min或室溫干燥；
15．用20μl滅菌水溶解DNA；
16．取5μl DNA溶液用495μl滅菌水稀釋，用UV分光光度計比色，讀取A₂₆₀和A₂₈₀吸光度值，計算出A₂₆₀ /A₂₈₀   比值及質粒DNA濃度。
 
六、結果   
1． 按下列公式計算DNA濃度： 
 
    質粒DNA濃度（μg/μl）= A₂₆₀×稀釋度/20= A₂₆₀×5 
                                                                                                                                                                
 2．質粒DNA的純度和含量測定結果：
          A260＝
          A280＝
          A₂₆₀／A₂₈₀＝
          質粒DNA含量＝        μg/μl；
 
3．若A₂₆₀ /A₂₈₀比值在⒈8---⒉0之間，說明質粒DNA純度高，
若A₂₆₀ /A₂₈₀＜⒈8，則說明提取的質粒DNA中，還有蛋白質沒有除去；
若A₂₆₀ /A₂₈₀＞⒉0，則說明提取的質粒DNA中，還有RNA沒有除去。
 
七﹑注意事項 
1．NaOH/SDS液需現用現配，且這一步反應需要充分混勻，使細胞裂解。
2．整個過程動作輕柔，防止提取的DNA鏈斷開。

    ⒈ GTE緩沖液：

3．堿裂解第11、14步離心后要緩慢倒上清液，防止將管底的DNA沉淀一起倒出。