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WB技術常見問題分析

2020-2-11 16:04:02      點擊:
樣品制備

問題

可能原因

驗證或解決辦法

樣品中有粘粘糊糊的東西

DNA從破碎的細胞中釋放出來

可以用酶,或機械方式將它打斷

加入上樣緩沖液后,樣品偏黃綠色

樣品的PH不對

使用緩沖液平衡PH值


制膠

問題

可能原因

驗證或解決辦法

膠不平

膠板上有雜質

膠板洗刷干凈

APS和TEMED過量

加入合適量的APS和TEMED

混合不均勻

加入試劑后搖勻,使其充分混合,防止部分膠塊聚合不均勻

受熱不均勻導致膠聚合不均勻

降低室溫

凝膠

漏液

膠板上有雜質

膠板洗刷干凈

底部漏液

對齊兩塊玻璃板底部

玻璃板是否有破損

更換玻璃板


電泳

問題

可能原因

驗證或解決辦法

“微笑”

“倒微笑”

條帶

凝膠聚合不均勻

凝膠過快

拔梳子時不要破壞加樣孔

清洗加樣孔時破壞了加樣孔

樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一

膠板底部有氣泡會影響電泳

電泳時電流太大

電泳時溫度過高

灌膠時候盡量混合均勻

聚合不能太快

拔梳子及清洗加樣孔要小心

純化樣品,調整鹽濃度

應趕走氣泡

減小電壓電流

降溫

條帶

扭曲

條帶

模糊

條帶比

正常的窄



蛋白轉印

問題

可能原因

驗證或解決辦法

凝膠腫脹或卷曲

凝膠內的液體不平衡

可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min

條帶歪斜或漂移

長期使用導致海綿變薄,“三明治”結構不緊湊導致。

可在兩塊海綿之間墊上少許普通的濾紙

單個或多個白點

氣泡阻礙了電流

確保膜和膠塊之間沒有氣泡

轉膜緩沖液過熱

緩沖液中離子濃度太低,電流或電壓太高。

轉膜過程注意降溫

轉膜

不充分

膜沒有完全均勻濕透

使用100% methanol浸透膜

靶蛋白分子量小于10,000

選擇小孔徑的膜,縮短轉移時間

靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值

可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液

甲醇濃度過高

過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離,從而沉淀在凝膠中,同時會使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替

轉移時間不夠Thick gel

對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間




其他

問題

可能原因

驗證或解決辦法

背景高

膜沒有完全均勻濕透

使用100% methanol浸透膜

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數

阻斷不充分

增加封閉液孵育時間,或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑(脫脂奶粉,BSA,酪蛋白等)

二抗濃度過高

降低二抗濃度

檢測過程中膜干燥

保證充分的反應液,避免出現干膜現象

曝光過度

縮短曝光時間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性,選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應

沒有

陽性條帶

抗體染色不充分

增加抗體濃度,延長孵育時間

酶失活

直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物

標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?煽紤]增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

試劑不匹配

一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性

一抗失效

選擇在有效期內抗體;并選擇現配現用的工作液

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

有陽性條帶,但條帶比較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度,延長孵育時間

酶活性降低

直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物

標本中靶蛋白含量太低

增加標本上樣量

洗膜過度

縮短洗滌時間

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內的抗體,工作液現配現用,避免長時間放置

蛋白轉移不充分

見上述

封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時間;換用不同封閉劑類型

曝光時間過短

延長曝光時間

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

條帶位置(大。┎粚;或有非特異性條帶

二抗的非特異性結合

增加一個對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗(特異性更強的,只針對重鏈的)

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標本,并使用蛋白酶抑制劑

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質變性過程及強度

抗體濃度過高

降低抗體(一抗、二抗)濃度,可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過大

降低上樣量

背景

有斑點

封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉試劑

HRP耦聯二抗中有聚集體

過濾二抗試劑,去除聚集體

膜上出現反像(暗背景上白色帶)

HRP含量過高

降低酶聯二抗的濃度

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