基因定點突變
2015-6-28 9:47:32 點擊：
一、定點突變的目的
把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。
二、定點突變的原理
通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產物，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。
三、引物設計原則
引物設計的一般原則不再重復。
突變引物設計的特殊原則：
（1）通常引物長度為25~45 bp，我們建議引物長度為30~35 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個bp，并且合成多一條反向互補的引物。
（2）如果設定的引物長度為30 bp，接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78℃（GC含量應大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78℃（GC含量應大于40%）。
（4）設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。
（5）最好使用經過純化的引物。
Tm值計算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物堿基數；% of GC：引物GC含量。
四、引物設計實例
以GCG→ACG為例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先設計30 bp長的上下游引物，并將A (T)設計在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過計算可以看出其Tm低于78℃，這樣的引物是不合適的，所以必須調整引物長度。
（3）重新調整引物長度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變實驗了。
五、突變所用聚合酶及Buffer
引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。
除了使用基因定點突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴�？梢允褂酶弑Ｕ娴木酆厦�，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。
六、如何去掉PCR產物
最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質粒）而不會影響PCR產物，從而去掉模板留下PCR產物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。
七、如何拿到質粒
直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質粒，拿去測序，驗證突變結果。
八、圖示
九、定點突變操作步驟
[A] 誘導突變基因（PCR反應）以待突變的質粒為模板，用設計的引物及Muta-direct™酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。
1. 設計點突變引物。
[注]參考引物設計指導
2. 準備模板質粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數低的現象，但是對突變效率沒有影響。提取質粒DNA時我們建議您使用本公司的質粒提純試劑盒。
3. [選項]對照反應體系（50μl反應體系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Control primer mix（20pmol/μl） 2μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
4. 樣品反應體系（50μl反應體系）
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl） 1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl） 1μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
5. PCR反應條件
[注]按如下參數設置PCR擴增條件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃ 30sec
15cycle 95℃ 30sec
55℃ 1min
72℃ 1min per plasmid Kb
6. PCR擴增反應完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復凍融）。
[注] 按下列提供的PCR條件進行擴增，控制PCR循環數。注意當突變點位點超過4個時會發生突變率降低的現象。
Mutation Cycles
1~2Nucleotide 15cycles
3Nucleotides 18cycles
[B] 突變質粒選擇
PCR反應結束后使用Mutazyme™酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。
1. 準備PCR反應產物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃溫育1小時。
[注]當質粒DNA用量過多時Mutazyme™酶可能發生與樣品反應不完全的現象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低，可以適當延長反應時間或增加Mutazyme™酶用量。
[C]轉化
反應完畢后在質粒DNA上會產生缺口，當把這個質粒DNA轉入E.coli中時請選擇dam+型菌株，例如DH5α。
1. 將10μl樣品加到50μl感受態細胞里，然后放置在冰上30分鐘。
2. 接下來可以參照一般的轉化步驟進行。
序列分析
通常當LB平板上出白色菌落則表明發生了突變。
為了證實這一結果，我們建議對白色單菌落進行測序分析。
把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。
二、定點突變的原理
通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產物，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。
三、引物設計原則
引物設計的一般原則不再重復。
突變引物設計的特殊原則：
（1）通常引物長度為25~45 bp，我們建議引物長度為30~35 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個bp，并且合成多一條反向互補的引物。
（2）如果設定的引物長度為30 bp，接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78℃（GC含量應大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78℃（GC含量應大于40%）。
（4）設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。
（5）最好使用經過純化的引物。
Tm值計算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物堿基數；% of GC：引物GC含量。
四、引物設計實例
以GCG→ACG為例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先設計30 bp長的上下游引物，并將A (T)設計在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過計算可以看出其Tm低于78℃，這樣的引物是不合適的，所以必須調整引物長度。
（3）重新調整引物長度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變實驗了。
五、突變所用聚合酶及Buffer
引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。
除了使用基因定點突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴�？梢允褂酶弑Ｕ娴木酆厦�，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。
六、如何去掉PCR產物
最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質粒）而不會影響PCR產物，從而去掉模板留下PCR產物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。
七、如何拿到質粒
直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質粒，拿去測序，驗證突變結果。
八、圖示
九、定點突變操作步驟
[A] 誘導突變基因（PCR反應）以待突變的質粒為模板，用設計的引物及Muta-direct™酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。
1. 設計點突變引物。
[注]參考引物設計指導
2. 準備模板質粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數低的現象，但是對突變效率沒有影響。提取質粒DNA時我們建議您使用本公司的質粒提純試劑盒。
3. [選項]對照反應體系（50μl反應體系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Control primer mix（20pmol/μl） 2μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
4. 樣品反應體系（50μl反應體系）
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl） 1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl） 1μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
5. PCR反應條件
[注]按如下參數設置PCR擴增條件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃ 30sec
15cycle 95℃ 30sec
55℃ 1min
72℃ 1min per plasmid Kb
6. PCR擴增反應完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復凍融）。
[注] 按下列提供的PCR條件進行擴增，控制PCR循環數。注意當突變點位點超過4個時會發生突變率降低的現象。
Mutation Cycles
1~2Nucleotide 15cycles
3Nucleotides 18cycles
[B] 突變質粒選擇
PCR反應結束后使用Mutazyme™酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。
1. 準備PCR反應產物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃溫育1小時。
[注]當質粒DNA用量過多時Mutazyme™酶可能發生與樣品反應不完全的現象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低，可以適當延長反應時間或增加Mutazyme™酶用量。
[C]轉化
反應完畢后在質粒DNA上會產生缺口，當把這個質粒DNA轉入E.coli中時請選擇dam+型菌株，例如DH5α。
1. 將10μl樣品加到50μl感受態細胞里，然后放置在冰上30分鐘。
2. 接下來可以參照一般的轉化步驟進行。
序列分析
通常當LB平板上出白色菌落則表明發生了突變。
為了證實這一結果，我們建議對白色單菌落進行測序分析。
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