感受態細胞的制備過程和原理
2015-6-28 9:36:47 點擊：
實驗目的
為了獲得很多的質粒作為克隆載體，咱們需要將購買來的質粒經過轉化的辦法導入細菌的細胞內。制備出感受態的細胞，咱們就能夠便利的將需克隆的質粒導入其中，使其繁衍，就能獲得很多質粒。本次試驗的意圖就是添加質粒的數量。同時，咱們能把握大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化的基本原理和試驗技術辦法。
1挑取一個JM109單菌落于3ml LB(無抗生素)培育基中，37℃，180rpm培育過夜。
[讓菌復蘇，進入對數期的早中期。此刻更簡單制得感受態細胞。]
2取0.4mL過夜培育物參加到40mL LB(無抗生素)培育基中，37℃250rpm大概2.5小時。
[削減到達所需亮的均所需繁衍的世代數，以削減菌的變異。]
3取培育物置于40mL的滅菌離心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃離心10min，棄上清。（將一切上清倒光，能夠將離心管倒過來）
[使細菌的成長中止，代謝減慢。由于這時現已沒有培育基了，假如細菌仍有很高的代謝功率，則有很多細菌逝世。]
4菌體重懸于10mL 100mmol/L嚴寒CaCl2中，輕吹，4℃ 30min，4000rpm離心5min棄上清。
[ 細菌處于0度，CaCl2低滲溶液中，菌細胞脹大成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞外表（羥基來源于細胞壁上的糖，磷酸來源于DNA），經短時間420C熱激處理，推進細胞吸收DNA復合物。（一定要輕吹，這時細胞壁翻開，非常軟弱）]
5菌體重懸于1mL 100mmol/L嚴寒的CaCl2中，輕吹，用于轉化。
[除去一切的LB以及細胞破損后釋放出來的細胞內含物。避免細胞分裂，致使很多細胞逝世。（一定要輕吹，這時細胞壁翻開，非常軟弱）]
6 取感受態細胞100uL，參加2uLpET-21a質粒，冰浴30 min受體菌：感受態細胞100uL，參加2 uL無菌雙蒸水陰性對照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，參加2 uL陰性對照
[ 第一個陰性對照是為了驗證LB中的抗生素有活性；第二個陰性對照是為了驗證CaCl2溶液和pET-21a質粒未被污染。]
[冰浴是為了降低細胞代謝率，避免細胞很多逝世。]
7 熱激 42度，90s
【在低溫處理后，熱激，能夠使細胞壁熱脹冷縮，再低溫，使細胞壁上黏附的質粒進入細胞體內�！�
8冰浴2 min
9參加800 uL 無抗生素的 LB，37℃復蘇1h
【用LB復蘇細胞，使細胞康復活力，從而使細胞中的質粒表達抗抗生素的基因，只要這樣才能使轉化成功的細菌在有抗生素的LB平板上成長�！�
10 取100ul細胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧芐西林)的LB培育基上鋪平板，將平皿放置37 oC溫箱30min至液體被吸收。倒置平皿37 oC培育過夜，出現菌落。
【 這些菌落為轉化成功的菌落，而對照組應當沒有菌落。在意圖菌落的旁邊有也許出現衛星菌落，這是由于畝的菌落的抗性基因似的菌落周圍的抗生素失效，長出了轉化為成功的菌落。用羧芐西林因其對酸安穩、不易被細菌降解，所以能夠降低衛星菌落的數量。
由于抗生素高溫易失活，所以應比及LB600C時（熱而不燙），參加抗生素�！�
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