組織和白細胞中基因組DNA的提取
2015-6-28 9:45:34 點擊：
一、 目的
掌握真核生物基因組DNA的提取方法。
二、 原理
高產量和高純度的真核生物DNA分離技術是進行PCR、Southern雜交、DNA文庫構建，及許多其它分子生物學研究的前提條件。真核生物基因組DNA位于細胞核內，與細胞核蛋白結合在一起。要提取真核細胞基因組DNA，必須去除與核酸結合的蛋白質、多糖、脂類以及RNA等生物大分子。采用組織勻漿法破碎細胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化細胞的蛋白質。該方法雖然傳統、簡單，但卻行之有效；不僅實驗操作具有相當大的靈活性，而且不需昂貴的儀器設備。其中SDS能破壞核膜使DNA釋放入水溶液，還可破壞細胞膜上的脂肪和蛋白質，并與蛋白質結合成復合物從而使蛋白質變性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金屬離子，抑制DNA酶對DNA的降解作用。這樣大分子DNA在乙醇中便以絮狀物析出，離心沉淀后再用70%的乙醇洗滌除鹽，干燥后溶于TE或雙蒸水中。以此法制備的DNA大小一般為40～150kb。
三、 儀器材料
（一）儀器
1．恒溫水浴鍋（北京醫療設備廠，型號：BS2-I）
2．高速離心機（Hema，型號：TGL-16H）
3．冷凍高速離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司，型號：TGL-18R）
4．-20℃冰箱（海爾集團青島電冰柜總廠 型號：BD-198S）
5．液氮罐（成都液氮容器廠，型號：YDS-35-125）
6．勻漿器
7．自動制冰機 (意大利SCOTSMAN公司 型號：AF-10)
（二）材料
1. 動物或人的組織標本
2. 人的血液標本
四、 試劑
1. DNA抽提緩沖液：
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2．液氮
3．蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作濃度100－200μg/ml。
4．平衡酚
5．氯仿
6．3M乙酸鈉（pH4.8）：稱取40.81g三水乙酸鈉溶于80.0ml水中，用冰乙酸調節pH值至4.8，定容至100ml。
7．預冷的100%乙醇
8．預冷的70%乙醇
9. 預冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 組織細胞基因組DNA的提取
1. 取新鮮組織或冰凍組織塊0.3-0.5cm3，盡量剪碎，加DNA抽提緩沖液400μl，在組織勻漿器中勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml Ep管中，用100μl DNA抽提緩沖液沖洗勻漿器，沖洗液一并轉入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至終濃度100-200μg/ml，混勻后放于37℃水浴5-12h，中間振搖數次。
3. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的Ep管，必要時重復抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
5. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預冷的70%乙醇洗滌沉淀。
7. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存備用。
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測定其在260nm和280nm處的吸光度值。
DNA含量（mg/ml）=A260×5
（二）白細胞基因組DNA的提取
1. 收集5～10ml抗凝血，3000rpm離心10min，棄去上層淡黃色的血漿，小心吸取白細胞層。
2. 用雙蒸水洗滌白細胞，使混雜的紅細胞溶血，3000rpm×10min離心數次，以去除紅細胞。
3. 收集白細胞沉淀，以適量雙蒸水或PBS重懸白細胞，移入1.5ml的離心管中，每管0.25ml。
4. 加入等體積（0.25ml）的2×DNA抽提緩沖液，加蛋白酶K至終濃度100～200μg/ml，混勻后放于37℃水浴2～5h。
5. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的1.5ml Ep管，必要時重復抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
7. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預冷的70%乙醇洗滌沉淀。
9. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存備用。
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測定其在260nm和280nm處的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260×稀釋倍數/20=A260×5
六、結果
0.5%的瓊脂糖凝膠（加入溴化乙錠至終濃度0.5μg/ml）電泳，即可見熒光顯色的DNA條帶。
七、注意事項
1. 組織塊取材應盡量新鮮，應在盡可能剪碎后進行勻漿。所用勻漿器須配套適中，過大過小均不利于研磨組織塊。
2. 蛋白酶K應盡量新鮮配制，在正式使用前應做預試驗以明確其活性。
3. 在進行平衡酚、氯仿抽提時，應盡量避免吸取蛋白質，以免影響DNA的純度。
4. DNA沉淀不能抽得太干，否則極難溶解。稍加熱可促進DNA的溶解。
掌握真核生物基因組DNA的提取方法。
二、 原理
高產量和高純度的真核生物DNA分離技術是進行PCR、Southern雜交、DNA文庫構建，及許多其它分子生物學研究的前提條件。真核生物基因組DNA位于細胞核內，與細胞核蛋白結合在一起。要提取真核細胞基因組DNA，必須去除與核酸結合的蛋白質、多糖、脂類以及RNA等生物大分子。采用組織勻漿法破碎細胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化細胞的蛋白質。該方法雖然傳統、簡單，但卻行之有效；不僅實驗操作具有相當大的靈活性，而且不需昂貴的儀器設備。其中SDS能破壞核膜使DNA釋放入水溶液，還可破壞細胞膜上的脂肪和蛋白質，并與蛋白質結合成復合物從而使蛋白質變性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金屬離子，抑制DNA酶對DNA的降解作用。這樣大分子DNA在乙醇中便以絮狀物析出，離心沉淀后再用70%的乙醇洗滌除鹽，干燥后溶于TE或雙蒸水中。以此法制備的DNA大小一般為40～150kb。
三、 儀器材料
（一）儀器
1．恒溫水浴鍋（北京醫療設備廠，型號：BS2-I）
2．高速離心機（Hema，型號：TGL-16H）
3．冷凍高速離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司，型號：TGL-18R）
4．-20℃冰箱（海爾集團青島電冰柜總廠 型號：BD-198S）
5．液氮罐（成都液氮容器廠，型號：YDS-35-125）
6．勻漿器
7．自動制冰機 (意大利SCOTSMAN公司 型號：AF-10)
（二）材料
1. 動物或人的組織標本
2. 人的血液標本
四、 試劑
1. DNA抽提緩沖液：
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2．液氮
3．蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作濃度100－200μg/ml。
4．平衡酚
5．氯仿
6．3M乙酸鈉（pH4.8）：稱取40.81g三水乙酸鈉溶于80.0ml水中，用冰乙酸調節pH值至4.8，定容至100ml。
7．預冷的100%乙醇
8．預冷的70%乙醇
9. 預冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 組織細胞基因組DNA的提取
1. 取新鮮組織或冰凍組織塊0.3-0.5cm3，盡量剪碎，加DNA抽提緩沖液400μl，在組織勻漿器中勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml Ep管中，用100μl DNA抽提緩沖液沖洗勻漿器，沖洗液一并轉入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至終濃度100-200μg/ml，混勻后放于37℃水浴5-12h，中間振搖數次。
3. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的Ep管，必要時重復抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
5. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預冷的70%乙醇洗滌沉淀。
7. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存備用。
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測定其在260nm和280nm處的吸光度值。
DNA含量（mg/ml）=A260×5
（二）白細胞基因組DNA的提取
1. 收集5～10ml抗凝血，3000rpm離心10min，棄去上層淡黃色的血漿，小心吸取白細胞層。
2. 用雙蒸水洗滌白細胞，使混雜的紅細胞溶血，3000rpm×10min離心數次，以去除紅細胞。
3. 收集白細胞沉淀，以適量雙蒸水或PBS重懸白細胞，移入1.5ml的離心管中，每管0.25ml。
4. 加入等體積（0.25ml）的2×DNA抽提緩沖液，加蛋白酶K至終濃度100～200μg/ml，混勻后放于37℃水浴2～5h。
5. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的1.5ml Ep管，必要時重復抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
7. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預冷的70%乙醇洗滌沉淀。
9. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存備用。
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測定其在260nm和280nm處的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260×稀釋倍數/20=A260×5
六、結果
0.5%的瓊脂糖凝膠（加入溴化乙錠至終濃度0.5μg/ml）電泳，即可見熒光顯色的DNA條帶。
七、注意事項
1. 組織塊取材應盡量新鮮，應在盡可能剪碎后進行勻漿。所用勻漿器須配套適中，過大過小均不利于研磨組織塊。
2. 蛋白酶K應盡量新鮮配制，在正式使用前應做預試驗以明確其活性。
3. 在進行平衡酚、氯仿抽提時，應盡量避免吸取蛋白質，以免影響DNA的純度。
4. DNA沉淀不能抽得太干，否則極難溶解。稍加熱可促進DNA的溶解。
- 上一篇：膠回收DNA注意事項 [2015/6/28]
- 下一篇：感受態細胞的制備過程和原理 [2015/6/28]
