膠回收DNA注意事項
①切膠回收DNA片段是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們 就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續麻煩。
②主要還是DNA的濃度， 如果DNA濃度不夠， 想膠小點也不可能。
③紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。
④利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個原因：膠塊未完 全溶解，可適當延長水浴時間，并增加上下顛倒次數輔助溶解；膠塊體積太大，應先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液pH太高，硅基質膜在高鹽低pH結合 DNA，如pH太高，應作適當調整；漂洗液中未加入無水乙醇。
⑤可以改用去離子水洗脫。但是實驗室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當調高其pH 值，以增加洗脫得率。
⑥洗脫產物含有殘留的乙醇會影響后續酶切實驗，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收 效率低的解決方案。
⑦不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進行洗脫以提高濃度，因為說明書 提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。
⑧電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續實驗對片段純度要求較高，建議 即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。
⑨瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過久， 使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存在4℃或-20℃；制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。
關于膠回收切膠的一點注意事項
1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。
2. 切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。
3. 關于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含 EB，可以采用點marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進行切膠。
4. 按照正常程序點marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對位置已 知，根據尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺得很難判斷，可以直接在marker邊點少量的樣，這樣位置就容易確定了。
一. 提高膠回收量的辦法
1) 增加電泳時的上樣量。
2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。
3) 切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。
4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉移到同一個柱子上。
5) 溶膠時所加的溶液可多一點，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過一般不要多余750ul。
6) 膠回收的關鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30%異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。
7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發。
8) 最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。
10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。
二. 幾種PCR產物回收的詳方法和步驟
1) 普通膠回收
    如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。
2) 從低熔點凝膠回收DNA
     純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結構分析，探針制備等）。
3) 擴增特異性好的PCR回收
    如果PCR擴增特異性好，只是簡單的PCR產物純化回收，可以在PCR產物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。
三. 不需膠回收就可直接連接的方法
1) 低溫冷凍析出法
跑電泳時用低熔點的agarose膠，跑到一定時候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個管子中，做好標記，放在－20度備用。
2) 酶切后的直接連接
在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進行連接是可以篩選出連接好的片斷的。
四、一些注意事項
1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。
2. 切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。
3. 關于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果你戴樹脂眼鏡就可以了。
4. 瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環境中（如果用柱子的話）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。
5. 如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標記的探針用X片，未標記的用EB。
6. 選用回收效率較高的柱子，比如進口的Qiaquick spin column。
7. 參照分子克隆用低熔點膠回收。除低熔點凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。
附注：影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：
1) DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）
2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA
Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb
1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.
3) DNA構象：一般遷移速率超螺旋環狀>線狀DNA>單鏈開環。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。
4) 所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm
5) 堿基組成與溫度：一般影響不大4-30 ℃
6) 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)
7) 電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。
3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。
二、實驗原理
    首先利用低熔點瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的條帶DNA，然后紫外光下切割含目的DNA條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質材料在一定的高鹽緩沖系統下高效、專一地吸附DNA、RNA的原理，配備設計獨特的離心吸附柱式結構，使用常規臺式高速離心機，在幾分鐘之內即可以高效回收核酸片段。
儀器與試劑
1、瓊脂糖凝膠電泳系統
2、紫外觀察分析儀
3、離心機
4、單面刀片
5、恒溫水浴鍋
注意事項：
 切膠時應快速操作，在紫外燈下時間長容易傷害到眼睛；
 溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時應使用長波長紫外燈，切膠時間盡量短。
 膠塊一定要充分融化，否則將會嚴重影響DNA的回收率。
 把洗脫液加熱，使用時有利于提高洗脫液效率。
    回收產物質量： 回收產物的質量主要指純度。 常規電泳過程中， 普通級別的瓊脂糖自帶的一些性狀不明的多糖， 會連同 DNA 一起從凝膠中抽提出來， 會強烈抑制后繼的連接、 酶切、 或者標記、 擴增等實驗。 從凝膠中回收 DNA 片斷， 產物的純度自然是我們考慮的第一要務。 對于大片斷 DNA 回收， 質量還包括了產物的完整與否， 如果機械剪切力使得回收產物大小不一致， 后果決不是你希望碰見的。 而對于較小片斷回收，質量其實還包括了回收產物的濃度。因為產物濃度太小，對后繼實驗同樣也有影響，比如連接、 標記實驗等等就很不爽，往往不得不再濃縮一次， 增加了操作的復雜性。此外，極微量的純化介質或者是某些試劑混入回收產物中也會對結果產生致命的影響。
    回收率：回收得率，是我們考慮的另一個重要參數。 由于上電泳的樣品量通常都很少， 電泳的過程本身也會導致樣品的分散和損失， 因而盡可能多的回收電泳凝膠條帶中的目的片斷， 提高產物得率， 對于后繼實驗來說是非常重要的。 回收率的多少通常和回收產物的大小以及量的多少有關， 比如 DNA 片斷越大， 和固相基質的結合力越強， 就越難洗脫， 回收率就低； 又比如說， DNA 的量越少， 相對損失越大， 回收率越低。因此， 根據情況選擇不同的方法是很重要的。 值得注意的是， 由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響， 所以回收率并非是一成不變的。 雖然是幾乎不需要實驗技巧的簡單操作，如果你注意到一些小技巧 還是很有幫助的。 DNA 回收純度取決于純化介質對 DNA 吸附的特異性、洗滌雜質是否徹底。而 DNA 回收率和濃度則與 elution buffer 的體積，以及 buffer 在柱子上停留的時間有關。 較大的洗脫體積可以提高回收率， 充分洗脫， 但是會造成產物濃度太低不好用。
一、實驗原理
    大腸桿菌經過處理后可以攝取外源 DNA（Plasmid DNA、 Phage DNA 等）， 處于這種狀態的細胞稱為感受態細胞（Competent Cell）。在基因工程實驗中，經常要使用各種感受態細胞進行 DNA 的轉化操作。實驗使用的感受態細胞的來源大體可以分為兩種： 一種是購買商品化的感受態細胞， 但商品化感受態細胞成本高、 運輸及保存有一定困難（超低溫）；另一種是自己制備感受態細胞，實驗人員自己制作感受態細胞時，往往受到各種試劑及實驗條件等限制，制備的感受態細胞效率低，達不到實驗要求。目前，感受態細胞的制備常用冰預冷的CaCl2處理細菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時處理快速生長的細菌，從而獲得感受態細菌。此時細菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基－鈣磷酸復合物粘附在細菌表面，通過熱激作用促進細胞對DNA的吸收。在一定條件下，經過連接后的DNA片段與感受態細胞混合保溫，可以進入感受態細胞。進入感受態細胞的DNA分子通過復制、表達，實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在選擇性培養基中培養，即可篩選出轉化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。
二、實驗所需器材和試劑
器材：恒溫搖床，電熱恒溫培養箱，臺式高速離心機，無菌工作臺，低溫冰箱， 恒溫水浴鍋， 制冰機， 分光光度計，微量移液槍。
試劑：
1.LB固體和液體培養基。
2.含特定抗生素的LB固體培養基。
3.100mM CaCl2溶液。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水，分析純)，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高壓滅菌。
5. 待轉化質粒。
四、實驗注意事項
1. 制作感受態細胞時應使用專用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷這些玻璃器皿或塑料容器時應盡量洗凈。由于微量的洗滌劑或污染物都可能降低感受態細胞的轉化效率， 因此在洗刷完用于制作感受態細胞的專用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去離子水浸泡一晚，然后再充分洗凈。
2. 制作感受態細胞時使用的菌種，不應使用4℃或常溫保存的傳代細菌。 應使用-70℃保存的菌種，在LB/抗生素平板培養基上分級劃線培養后， 挑取單菌落。 使用這種菌種制作的感受態細胞， 能提高轉化效率。
3. 培養感受態細胞制備用菌體時， OD 600值的測定應隨時進行， 以使 OD 600 值控制在0.35～0.5之間。如果 OD 600值超出此范圍，可能降低感受態細胞的轉化效率。
4. 用于感受態細胞制備的菌體培養停止后要立即處理， 不要將培養液過長時間室溫放置，在冰中放置時也不要時間過長。
5. 感受態細胞的制備操作過程中，離心后棄上清時要盡量棄盡，否則會降低感受態細胞的轉化效率。
6. 使用 Solution A、Solution B 懸浮沉淀時要用手指輕輕彈動 Microtube 管壁，禁止劇烈震蕩操作。
7. 為了有效確認感受態細胞的轉化效率， 最好制作一批高純度的質粒 DNA 分裝低溫（-20℃）保存， 用作陽性對照，以確認每批制作的感受態細胞的轉化效率。
感受態細胞的制備方法
1. 菌種純化
① 使用LB/抗生素平板培養基（根據菌種性質加入適當的抗生素），用接種針挑取大腸桿菌（-70℃甘油保存菌），在平板培養基上分級劃線，以能夠出現單菌落為宜。
② 將上述劃線的平板培養基倒置于恒溫培養箱中 37℃過夜培養。
2. 菌體培養
① 取20 ml φb×broth移至100 ml三角燒瓶中，塞上棉塞后高溫高壓滅菌，然后冷卻至室溫。
② 在劃線平板培養基上挑取單菌落，接種到①的培養基中。
③ 37℃振蕩（約 120 rpm）培養。
④ 測定OD 600值，當 OD 600 值達到0.35～0.5時（約培養5小時）放置冰中停止培養（如果 OD 600值超出此范圍將不能保證感受態細胞的轉化效率）。
⑤ 進行下一步操作。
3. 感受態細胞的制備
① 取上述菌體培養液 1 ml 于 1.5 ml Microtube 中（根據需要量確定 Microtube 數量）
② 1，500×g（一般的微型離心機約 4，000 rpm）4℃離心 5 分鐘，棄上清（注意盡量除盡上清）
③ 在每個 Microtube 中加入 100 μl 冰中預冷的 Solution A， 輕輕彈動 Microtube 使沉淀懸浮， 禁止劇烈振蕩
④ 1，500×g（一般的微型離心機約 4，000 rpm）4℃離心 5 分鐘，棄上清（注意盡量除盡上清）
⑤ 在每個 Microtube 中加入 100 μl 冰中預冷的 Solution B， 輕輕彈動 Microtube 使沉淀懸浮， 禁止劇烈振蕩
⑥ 感受態細胞制作完成。本感受態細胞可以直接用于 DNA 的轉化實驗，也可以于-80℃中保存，以備以后使用。在-80℃保存時，可以有效保存一年以上，但不能反復凍融，一旦融解后，不能再進行-80℃保存
感受態細胞的 DNA 轉化
1. 將-80℃保存的感受態細胞置于冰中融化 10 分鐘。
2. 取 100 μl 的感受態細胞移至新的轉化管中。
3. 向感受態細胞中加入 0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl）的轉化用 DNA， 輕輕混勻后冰中放置 30 分鐘。
4. 42℃水浴中放置 45 秒鐘后，立即于冰中放置 1～2 分鐘。
5. 加入 890 μl 37℃預溫的 SOC 培養基。
6. 37℃振蕩培養 1 小時。
7. 取適量涂平板后，將平板倒置于 37℃培養箱中培養一夜。
8. 確認培養菌落，進行下步實驗。
為了提高轉化效率， 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1. 細胞生長狀態和密度: 細胞生長密度以剛進入對數生長期時
為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%。
3. 試劑的質量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行。